第二章 臨床生物化學實驗技術(shù)

一、光譜檢驗技術(shù)
利用各種化學物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。在臨床生物化學檢驗中，光譜分析是一類十分重要的技術(shù)，應(yīng)用極為廣泛。它既可以研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，也可以對特定物質(zhì)進行定性或定量的分析根據(jù)物質(zhì)對光譜響應(yīng)特征的不同，可把光譜檢驗技術(shù)分為發(fā)射光譜分析技術(shù)、吸收光譜分析技術(shù)和散射光譜分析技術(shù)三大類。
可見-紫外光分光光度法利用朗伯－比爾定律作為化學反應(yīng)定量的基礎(chǔ)，應(yīng)重點掌握該定律的應(yīng)用、使用條件和各個變量間的關(guān)系，從而根據(jù)已有的結(jié)果計算需要的變量。
吸光系數(shù)是表示物質(zhì)特性的常數(shù)，是物質(zhì)鑒定的基礎(chǔ)，根據(jù)物質(zhì)的吸光系數(shù)可以進行定量測定，但應(yīng)注意其使用的條件。在化學反應(yīng)中盡量選擇吸光系數(shù)大的物質(zhì)，可以提高測定的靈敏度。
在分光光度法的建立中，應(yīng)掌握波長的選擇、雙波長測定的原理和抗干擾的原理。在可能的情況下應(yīng)選擇靈敏度高、選擇性好的顯色劑，同時需要應(yīng)用適當?shù)男�準方式和計算方程式�?br /> 在定量分析中，大量使用分光光度計。該類儀器屬于比較精密的分析計器，使用要求比較嚴格。其中單色光的純度和波長的準確性直接影響到測定結(jié)果的準確性和精密度。在使用前和使用過程中應(yīng)進行光源的檢查和波長的校正。
原子吸收分光光度法是基于光源輻射出具有待測元素特征譜線的光，通過原子化器，被其中待測元素的基態(tài)原子所吸收，根據(jù)吸收而導致輻射特征譜線光被減弱的程度來測定待測元素的含量。與其它分析方法比較，它具有靈敏、準確、分析速度快、干擾少、無需化學反應(yīng)和測量元素含量范圍較廣等優(yōu)點。由于其檢測靈敏度較高，操作環(huán)節(jié)比較多，而且每種元素需要一種的光源燈，因此在臨床實驗室一般較少應(yīng)用于常規(guī)分析。
熒光分析法是利用某些物質(zhì)吸收了一定波長的光能后，分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，此類電子經(jīng)與同類分子或它種分子相互碰撞，消耗相當，而下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能階。最低能階下降到基態(tài)，同時發(fā)射出比原來所吸收的頻率較低，波長較長的光能，稱為熒光。利用元素的原子所發(fā)射的共振熒光波長的差異，可確定元素的種類或物質(zhì)分子中某種結(jié)構(gòu)，從熒光的強弱可以測定物質(zhì)的含量。熒光分析定量是基于熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的溫度下，當激發(fā)光的波長、強度、熒光測定波長以及液層厚度一定時，所測得的熒光強度F與該溶液中熒光物質(zhì)的濃度C成正比，F(xiàn)=kC。采用標準曲線法或直接比較法，對熒光物質(zhì)進行定量。 熒光分析法靈敏度高，可以進行微量分析和定量測定較微量的物質(zhì)。但該方法影響因素較多，因此，在進行熒光分析時應(yīng)嚴格控制各種條件才能獲得靈敏、準確的分析結(jié)果。

二、電化學分析技術(shù)
電化學傳感器在臨床生化分析的應(yīng)用中占據(jù)著主導的地位。其原理是將電極浸入待測溶液中組成原電池，其中一支電極的電極電位與待測離子的活度有關(guān)，其關(guān)系服從Nernst方程，此電極稱為指示電極；另一支電極是電位已知并且恒定的所謂參比電極,目前最常用的參考電極有甘汞電極和銀-氯化銀電極。
離子選擇電極法根據(jù)標本情況又可分為直接法和間接法。直接法是用離子選擇電極直接測定生物體液中的被測物質(zhì)；間接法則是將標本進行預稀釋，然后再進行測定，使得標本的使用量更少。間接法由于將標本進行了預稀釋，可以控制其離子強度，也就是控制其活度系數(shù)，但間接法由于標本被稀釋，測定結(jié)果比直接法低。
ISE具選擇性好、靈敏度高，、線性范圍寬、溶血、脂血及黃疸不影響測定，對有色、渾濁溶液都可進行分析、設(shè)備簡單，分析速度快，易于自動化，標本用量少等優(yōu)點，在臨床上應(yīng)用廣泛。

三、電泳技術(shù)
電泳技術(shù)應(yīng)用廣泛，在生物化學實驗技術(shù)中占有重要地位，主要用于蛋白質(zhì)、核酸等的分離、鑒定和定量。目前已經(jīng)發(fā)展到自動化的電泳系統(tǒng)，整個電泳過程包括點樣、電泳、脫色、掃描定量都實現(xiàn)了自動化操作。同時用半干膠技術(shù)取代液體緩沖液，使得電泳操作更規(guī)范簡便，電泳結(jié)果重現(xiàn)性更好。
應(yīng)掌握電泳的原理、影響因素、各種電泳的特點和使用范圍。

四、常用免疫分析技術(shù)
隨著單克隆抗體的開發(fā)和使用、各種標記技術(shù)的發(fā)展使得免疫學進入了一個新的時期。由于免疫分析技術(shù)具有特異性好、快速、靈敏度高等，使得熒光分析法其應(yīng)用范圍十分廣泛，在臨床生物化學中可以對內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、腫瘤標志物、血藥濃度等血清微量物質(zhì)進行定量測定。
免疫比濁分析分為散射免疫比濁分析和透射免疫比濁分析，應(yīng)掌握它們的原理、適用條件、影響因素和臨床應(yīng)用。
酶免疫分析是將酶催化的放大作用與抗原、抗體的免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種標記免疫分析技術(shù)。與放射免疫分析相比其最大優(yōu)勢在于避免了放射性核素對人體的損害、核素標記的抗原或抗體批間差異大，酶標記物具有明顯較長的有效期和不需特殊設(shè)備等。近年來在EIA中又引進了放大系統(tǒng)，派生出熒光酶免疫分析、增強化學發(fā)光酶免疫分析等，使檢測的靈敏度大大提高，應(yīng)用范圍不斷擴大。應(yīng)掌握均相EIA和非均相EIA的原理，各種方法的優(yōu)缺點和應(yīng)注意的問題。
化學發(fā)光免疫分析近十年來得到了很大發(fā)展，與微粒子發(fā)光免疫分析生物發(fā)光免疫分析、增強化學發(fā)光分析和電化學發(fā)光等以其靈敏度高、檢測速度快、操作簡便、所用試劑對人體無危害的優(yōu)點，成為非放射性免疫分析技術(shù)中最具有發(fā)展前途的方法之一。主要掌握它們的原理和在臨床中的應(yīng)用。
時間分辨熒光免疫分析以鑭系元素為標記物，是一種全新的非放射性標記免疫技術(shù)和超靈敏度的檢測技術(shù)。其主要特點是以稀土元素銪（Eu3+）標記抗原或抗體為示蹤劑。利用增強液的熒光放大作用和時間分辨熒光測量法排除樣品或試劑中非特異性熒光物質(zhì)的干擾，最大限度地提高了熒光信號測量的特異性和檢測方法的靈敏度、操作方法簡便、標記物制備容易、穩(wěn)定性好、不污染環(huán)境和易于自動化等優(yōu)點。

五、其他檢驗技術(shù)
離心機是利用物質(zhì)的高速旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生強大的離心力，使置于該旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達到濃縮或與其他顆粒分離的目的。離心機的種類繁多，用途各異。在使用中應(yīng)掌握離心力的換算，沉降系數(shù)的意義和表示方法，離心機使用中應(yīng)注意的問題。
高效液相層析法是用特制微粒（<10um）充填的層析柱作為固定相，通過高壓使液體流動相快速通過層析柱而達到快速有效分離液相中各種物質(zhì)的層析技術(shù)。它具有分離效果好、分析速度快，檢測靈敏度高等特點。在醫(yī)藥衛(wèi)生和生物化學中得到廣泛的應(yīng)用，蛋白質(zhì)、糖類、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等大分子以及高分子聚合物度能用HPLC測定。
放射免疫分析是利用了現(xiàn)代放射性測量技術(shù)的高度敏感性和精確性，靈敏度高，是一種超微量的分析技術(shù)。同時，由于其分析原理是基于抗原與抗體間高度專一性的結(jié)合反應(yīng)，因而它具有很高的特異性，能從組分十分復雜的樣品中準確地測出某一特定組分的含量而不受其它組分的干擾。其分析原理是：用放射性核素標記配體或結(jié)合劑，在配體與結(jié)合劑之間競爭性或非競爭性的可逆性結(jié)合反應(yīng)，形成配體－結(jié)合劑復合物，其反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律。放射免疫分析根據(jù)結(jié)合反應(yīng)原理及方法學設(shè)計原理的不同有許多類型。主要用于激素、微量蛋白等的定量測定，在臨床中應(yīng)用較廣。
生物傳感器是指固定化的生物體內(nèi)成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身（細胞、細胞器、組織等）為敏感元件組成的傳感器。生物傳感器這種新的檢測手段與傳統(tǒng)的生物化學相比具有以下的主要特點為①生物傳感器是用選擇性好的生物體材料作為敏感材料，因此一般不需要進行樣品的前處理，一般也不需另加其他試劑，使用簡便、快速、準確；；②由于它的體積小，可以實現(xiàn)連續(xù)在位檢測，聯(lián)機操作；③響應(yīng)快，樣品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反復多次使用；④傳感器連同測定儀器的成本遠低于大型的分析儀，便于推廣普及。
生物傳感器根據(jù)利用的生物物質(zhì)的不同可分為兩類。一類是利用酶、細胞內(nèi)小器官、細胞、組織等具有輔酶特性物質(zhì)的生物催化傳感器。酶傳感器、微生物傳感器和組織傳感器屬于此類；另一類是利用抗體、結(jié)合蛋白質(zhì)、激素受體、DNA、RNA等具有親和性物質(zhì)的傳感器。免疫傳感器、受體傳感器、DNA傳感器屬于這類。
生物芯片是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量、種類等信息。根據(jù)芯片上的固定的探針不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片，另外根據(jù)原理還有元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白，則稱為肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探針或DNA，就是DNA芯片。
生物芯片技術(shù)應(yīng)用于疾病的診斷、新藥開發(fā)、基因測序、基因表達分析、尋找新基因、突變和多態(tài)性研究等諸多方面。生物芯片技術(shù)雖然還處在初期發(fā)展階段，它的飛速發(fā)展正在逐步改變著人們對生物體的認識，隨著這一技術(shù)的深入發(fā)展，它將對臨床疾病診斷、疾病發(fā)生機理的認識和新藥開發(fā)都將是一個重要的研究手段。但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術(shù)成本昂貴、復雜、檢測靈敏度較低，重復性差、分析泛圍較狹窄等問題。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個方面。