第六章　臨床生化自動(dòng)化分析

自動(dòng)生化分析儀將生化分析中的取樣、加試劑、混勻、保溫反應(yīng)、檢測、結(jié)果計(jì)算、可靠性判斷、顯示和打印、以及清洗等步驟組合在一起自動(dòng)操作。按其工作方式不同分為連續(xù)流動(dòng)式或管道式、分立式、離心式和干片式。

一、分立式自動(dòng)生化分析儀的結(jié)構(gòu)

(一)基本結(jié)構(gòu)

1.樣品盤或樣品架 樣品盤是能放置樣品杯或采血試管的轉(zhuǎn)盤;樣品架是能放置樣品杯或采血試管的架子，可通過樣品傳送帶進(jìn)行移動(dòng)，其優(yōu)點(diǎn)是可不斷追加新的樣品架，以及能將樣品傳送到另一分析模塊甚至另一分析儀上再進(jìn)行分析。

2.試劑室和試劑瓶 試劑室內(nèi)可裝有放置試劑瓶的轉(zhuǎn)盤，轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)某一試劑瓶內(nèi)試劑被吸取;或擺放許多試劑瓶，每個(gè)試劑瓶內(nèi)引出一條試劑管路及其噴嘴。試劑室均具有冷藏裝置。大型分析儀常有第一試劑室和第二試劑室。

3.反應(yīng)杯和反應(yīng)盤 反應(yīng)杯即作反應(yīng)管又作比色杯，由透光性好的硬塑料或石英玻璃制成，反應(yīng)杯圍成一圈組成一個(gè)反應(yīng)盤，在測定過程中作恒速圓周運(yùn)動(dòng)，靜止時(shí)向反應(yīng)杯中加入樣品、試劑或進(jìn)行攪拌混勻，相對靜止時(shí)經(jīng)過檢測窗口的比色杯可進(jìn)行吸光度檢測。

4.取樣和加試劑裝置 取樣裝置由取樣針、取樣臂、取樣管路、取樣注射器和閥門組成，取樣針尖具液面感應(yīng)功能，并設(shè)有防撞裝置。取樣針大多數(shù)采用水洗方式，也有采用化學(xué)惰性液的方式。加試劑裝置有兩類，一種類型的組成與取樣裝置類似，其液面感應(yīng)系統(tǒng)能檢測并提示試劑剩余量。另一種類型為灌注式，每種試劑單獨(dú)使用一條試劑管路和噴嘴，因而不存在各試劑間的交叉污染。

5.混勻與攪拌裝置 樣品與試劑通過棒攪充分混勻。

6.溫控和定時(shí)系統(tǒng) 反應(yīng)杯浸浴在恒溫循環(huán)水或恒溫空氣中。檢測吸光度有一定間隔時(shí)間，總反應(yīng)時(shí)間一般在8-10min內(nèi)。

7.光路和檢測系統(tǒng) 光源一般為鹵素鎢絲燈，也有采用長壽命的氙燈。單色器采用干涉濾光片分光系統(tǒng)，或光柵分光系統(tǒng)，常用波長有340、380、405、500、550、600、660nm等。光柵分光有前分光和后分光兩種方式，后分光是光源先透過比色杯中的反應(yīng)液再照射到光柵上。檢測器由光敏二極管及放大電路組成。

8.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 能計(jì)算測定結(jié)果、判斷結(jié)果準(zhǔn)確性、保存各種數(shù)據(jù)和自我診斷功能等。

9.清洗系統(tǒng) 反應(yīng)和檢測結(jié)束后反應(yīng)杯就被沖洗系統(tǒng)及時(shí)沖洗，然后做杯空白吸光度檢查;樣品針、試劑針和攪拌棒一般在用于下一個(gè)樣品、試劑或反應(yīng)杯前即清洗一次;在一批檢測完成后，則自動(dòng)進(jìn)行清洗劑清洗，清洗劑可配有1至3種。

(二)組合式自動(dòng)分析儀

組合式自動(dòng)生化分析儀將相同或不同的兩臺或兩臺以上的分析部分，采用樣品架方式使樣品通過傳輸線在不同分析模塊間進(jìn)行傳遞并檢測。實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化系統(tǒng)組合各自動(dòng)分析系統(tǒng)如生化分析系統(tǒng)、免疫分析系統(tǒng)以及血液分析系統(tǒng)等，可包括樣品前處理系統(tǒng)、樣品輸送系統(tǒng)和各樣品分析系統(tǒng)。

二、生化自動(dòng)化分析方法概要

(一)分析方法類型

1.終點(diǎn)法 被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，根據(jù)終點(diǎn)吸光度的大小求出被測物濃度，實(shí)際上稱為平衡法更為恰當(dāng)。

一點(diǎn)終點(diǎn)法是在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值計(jì)算結(jié)果。兩點(diǎn)終點(diǎn)法則在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時(shí)選擇第一個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，將兩點(diǎn)吸光度之差計(jì)算結(jié)果。該法能有效地消除溶血、黃疸和脂濁等樣品本身光吸收造成的干擾。在雙試劑分析中，如果將第一吸光度選擇在第二試劑加入前，此時(shí)指示反應(yīng)一般尚未開始，則能容易設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法。

2.固定時(shí)間法 指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問題，例如苦味酸法測定肌酐。

3.連續(xù)監(jiān)測法 又稱速率法，是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時(shí)，連續(xù)選取時(shí)間-吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此期單位時(shí)間吸光度變化值(ΔA/min)計(jì)算結(jié)果。該法的優(yōu)點(diǎn)是可以確定線性期并計(jì)算ΔA/min，從而可準(zhǔn)確計(jì)算酶活性。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。

4.透射比濁法 抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，在反應(yīng)液中具有一定的濁度，進(jìn)行透射比濁測定，可用于某些蛋白質(zhì)和藥物濃度等的測定。

(二)常用生化檢測項(xiàng)目分析方法舉例

1.終點(diǎn)法檢測　總膽紅素、結(jié)合膽紅素、血清總蛋白、血清白蛋白、總膽汁酸、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇(直接測定法)、鈣、磷(紫外法)、鎂等。

2.固定時(shí)間法　苦味酸法測定肌酐等。

3.連續(xù)監(jiān)測法　酶活性如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ谷氨氨酰基轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定如葡萄糖(己糖激酶法)、尿素(脲酶偶聯(lián)法)等。

4.透射比濁法　載脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗"O"、類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。

三、分析參數(shù)設(shè)置

(一) 分析參數(shù)介紹

1.必選分析參數(shù) 是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數(shù)無法進(jìn)行檢測。包括試驗(yàn)名稱(test code)、方法類型(也稱反應(yīng)模式)(assay mode)、反應(yīng)溫度、主波長(primary wavelength)、次波長(secondary wavelength)、反應(yīng)方向(response direction)、樣品量(sampling volum，一般是2μl～35μl，以0.1μl步進(jìn)，個(gè)別分析儀最少能達(dá)到1.6μl。可設(shè)置常量、減量和增量)、第一試劑量 (first reagent volum一般是20～300μl，以1μl步進(jìn))、第二試劑量(second reagent volum)、總反應(yīng)容量(total reacting volum，一般是180～350μl，個(gè)別儀器能減少至120μl)、孵育時(shí)間(incubate time，在終點(diǎn)法是樣品與試劑混勻開始至反應(yīng)終點(diǎn)為止的時(shí)間，在兩點(diǎn)法是第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)開始至第二個(gè)吸光度選擇點(diǎn)止的時(shí)間)、延遲時(shí)間(delay time，連續(xù)監(jiān)測法中樣品與反應(yīng)試劑混勻開始至連續(xù)監(jiān)測期第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)之間的時(shí)間)、連續(xù)監(jiān)測時(shí)間(continuous monitoring time，延遲時(shí)間之后即開始，一般為60～120s，不少于4個(gè)吸光度檢測點(diǎn))、校準(zhǔn)液(calibrator)個(gè)數(shù)及濃度或或理論K值、小數(shù)點(diǎn)位數(shù)(decimal point digit)。

2.備選分析參數(shù)　這類分析參數(shù)與檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān)，一般來說不設(shè)置這類分析參數(shù)，分析儀也能檢測出結(jié)果。包括線性范圍(linearity range)、樣品預(yù)稀釋、底物耗盡值(substrate exhaust limit，在負(fù)反應(yīng)的酶活性測定中，規(guī)定的吸光度下降限。若低于此限時(shí)底物已太少，不足以維持零級反應(yīng)而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確)、前區(qū)檢查(將終點(diǎn)法最后兩個(gè)吸光度值的差別設(shè)置一個(gè)限值，如果后一點(diǎn)的吸光度比前一點(diǎn)低，表示已有抗原過剩)、試劑空白吸光度范圍、試劑空白速率、方法學(xué)補(bǔ)償系數(shù)(用于校正不同分析方法間測定結(jié)果的一致性，有斜率和截距兩個(gè)參數(shù))、參考值范圍。

3.某些參數(shù)的特殊意義 最小樣品量、最大試劑量、彈性速率和試劑空白速率等。彈性速率(flexrate)指在酶活性測定中，酶活性太高時(shí)在連續(xù)監(jiān)測期中已不呈線性反應(yīng)時(shí)，有些儀器具有彈性速率功能，能自動(dòng)選擇反應(yīng)曲線上連續(xù)監(jiān)測期中仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果。

(二)單波長和雙波長方式

采用一個(gè)波長檢測物質(zhì)的光吸收強(qiáng)度的方式稱為單波長方式，使用一個(gè)主波長和一個(gè)次波長的稱雙波長方式。雙波長測定能①消除噪音干擾;②減少雜散光影響;③減少樣品本身光吸收的干擾。選擇次波長應(yīng)使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應(yīng)有較大的差異，一般來說，次波長應(yīng)大于主波長100nm。

(三)單試劑和雙試劑方式

反應(yīng)過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優(yōu)點(diǎn)是：①可提高試劑的穩(wěn)定性;②能設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法;③在某些項(xiàng)目檢測時(shí)能消除非特異性化學(xué)反應(yīng)干擾。

(四)測定過程的自動(dòng)監(jiān)測

1.試劑空白監(jiān)測　試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)。

2.試劑空白變化速率監(jiān)測　一些酶試劑或其他試劑在反應(yīng)溫度下不穩(wěn)定，其空白吸光度可隨著時(shí)間逐漸發(fā)生變化，這種變化會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。設(shè)置此項(xiàng)監(jiān)測可使分析儀在結(jié)果計(jì)算時(shí)自動(dòng)減去試劑空白變化速率。

3.樣品信息監(jiān)測　根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質(zhì)和程度，然后在結(jié)果計(jì)算時(shí)自動(dòng)減去這部分干擾。

4.結(jié)果可靠性監(jiān)測 終點(diǎn)監(jiān)測：判斷所選的測光點(diǎn)是否到達(dá)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)。線性期監(jiān)測：①將連續(xù)監(jiān)測到的各吸光度值進(jìn)行線性回歸，根據(jù)各點(diǎn)方差值的大小來判斷是否呈線性;②取連續(xù)監(jiān)測期開始若干點(diǎn)的變化速率與連續(xù)監(jiān)測期最后若干點(diǎn)的變化速率進(jìn)行比較來判斷是否為線性期。

5.底物消耗的監(jiān)測　在連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性時(shí)，如果在監(jiān)測期內(nèi)吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡。

6.方法線性范圍監(jiān)測

四、自動(dòng)生化分析儀的工作過程和操作方法

(一)工作過程

在測定過程中所有機(jī)械步驟均由微處理器根據(jù)已設(shè)定的程序進(jìn)行工作。包括取樣加試劑和混勻、保溫反應(yīng)和吸光度檢測和計(jì)算并顯示或打印結(jié)果。

(二)操作方法

操作步驟如下：

1.操作前的各項(xiàng)檢查

2.校準(zhǔn) 校準(zhǔn)方式有單點(diǎn)校準(zhǔn)、兩點(diǎn)校準(zhǔn)和多點(diǎn)校準(zhǔn)，多點(diǎn)校準(zhǔn)可按其線形選擇不同的曲線方程進(jìn)行擬和，如雙曲線、拋物線、冪函數(shù)、指數(shù)函數(shù)、對數(shù)函數(shù)等方程等。校準(zhǔn)頻度按檢測方法原理和試劑的穩(wěn)定性不同而確定，如每日校準(zhǔn)、每周校準(zhǔn)、每月校準(zhǔn)、每兩月校準(zhǔn)等，至少每六個(gè)月進(jìn)行一次校準(zhǔn)。

3.質(zhì)控品測定

4.檢測項(xiàng)目的輸入與測定

5.樣品的減量重做

6.分析儀維護(hù) 要嚴(yán)格根據(jù)操作手冊的要求，進(jìn)行每天維護(hù)、每周維護(hù)、不定期維護(hù)等。

7.分析儀數(shù)據(jù)連網(wǎng) 指分析儀與實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)之間分析數(shù)據(jù)的互傳與共享。

(三)自動(dòng)化分析與手工操作的比較

1.優(yōu)點(diǎn) 包括檢測速度快、檢測靈敏度高、檢測準(zhǔn)確度高、檢測精密度高、樣品和試劑用量少，以及能精確地控制反應(yīng)時(shí)間、精確地控制反應(yīng)溫度和進(jìn)行復(fù)雜的結(jié)果計(jì)算等。

2.缺點(diǎn)　選擇次波長較困難、操作時(shí)間受限、操作復(fù)雜性受限(如加試劑的次數(shù)，無法離心、過濾、萃取、煮沸，選擇和改變反應(yīng)溫度困難等)、樣品量/試劑量的比例受限制、不適宜做參考方法，以及儀器維護(hù)和保養(yǎng)較復(fù)雜等。

五、干片式生化分析儀簡介

由干片試劑和檢測儀器兩部分組成，前者從上到下分為展開層、試劑層、顯色層和支持層，檢測儀器也有半自動(dòng)和全自動(dòng)之分。測定不同待測物利用不同的方法原理。樣品在干片試劑各層中的反應(yīng)過程如下：

(1)待測樣品在展開層樣品均勻展開，大分子物質(zhì)被阻擋不能進(jìn)入試劑層。

(2)樣品中的水分進(jìn)入試劑層成為干式試劑的溶劑，試劑與待測物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。

(3)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物在顯色層與顯色試劑起呈色反應(yīng)。

(4)經(jīng)過一定時(shí)間，光度計(jì)的單色光透過支持層、顯色層和試劑層，一部分光線被吸收，另一部分光線則反射到接收器被檢測。

六、自動(dòng)生化分析儀性能評價(jià)

生化分析儀有全自動(dòng)和半自動(dòng)之分。全自動(dòng)分析儀將取樣至出結(jié)果的全過程都自動(dòng)完成。半自動(dòng)分析儀的工作原理為連續(xù)流動(dòng)式分析，不同樣品反應(yīng)液之間互染率大，每個(gè)樣品檢測后均需沖洗才能進(jìn)行下一個(gè)測定，某些步驟如加試劑、取樣、混合、保溫等需手工完成。

生化分析儀的分析性能也包括準(zhǔn)確度、精密度、檢測范圍等，另外，分析速度是自動(dòng)生化分析儀最重要的分析性能。

(一)分析速度

影響分析速度的因素有通道數(shù)量、取樣周期、反應(yīng)杯數(shù)量、一次能容納的樣品數(shù)量、試劑瓶容量、合適的項(xiàng)目組合等。

(二)分析儀性能指標(biāo)

自動(dòng)生化分析儀的性能可包括五個(gè)方面：準(zhǔn)確度、精密度、檢測能力(包括檢測方法、檢測時(shí)間、加試劑次數(shù)、檢測范圍等)、分析速度和檢測成本，分析儀生產(chǎn)廠家關(guān)于其分析儀的介紹資料中通常列出許多性能指標(biāo)，這些指標(biāo)實(shí)際上是這五方面性能的解釋。