第四章 臨床生化檢驗(yàn)方法的選擇和評(píng)價(jià)

一、 檢驗(yàn)方法的正確選擇

臨床生化檢驗(yàn)方法根據(jù)其準(zhǔn)確度與精密度的不同可以分為決定性方法、參考方法、常規(guī)方法等三級(jí)。

1.決定性方法 是指準(zhǔn)確度最高，系統(tǒng)誤差最小，經(jīng)過(guò)詳細(xì)的研究，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法。用于發(fā)展及評(píng)價(jià)參考方法和一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。

2.參考方法 是指準(zhǔn)確度與精密度已經(jīng)充分證實(shí)的分析方法，干擾因素少，系統(tǒng)誤差與重復(fù)測(cè)定的隨機(jī)誤差相比可以忽略不計(jì)，有適當(dāng)?shù)撵`敏度、特異性及較寬的分析范圍。這類(lèi)方法在條件許可的實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)經(jīng)常使用。用于評(píng)價(jià)常規(guī)方法和試劑盒，鑒定二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。

3.常規(guī)方法 指性能指標(biāo)符合臨床或其他目的的需要，有足夠的精密度、準(zhǔn)確度、特異性和適當(dāng)?shù)姆治龇秶�，而且�?jīng)濟(jì)實(shí)用。這類(lèi)方法經(jīng)有關(guān)學(xué)術(shù)組織認(rèn)可后可稱(chēng)為推薦方法，推薦方法應(yīng)具有足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)將標(biāo)準(zhǔn)品(參考物)的定義暫定為：它的一種或幾種物理或化學(xué)性質(zhì)已經(jīng)充分確定;被用于校正儀器或用于評(píng)價(jià)一種測(cè)定方法的物質(zhì)，并將其分成三級(jí)。

1.一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品(原級(jí)參考物) 是一種穩(wěn)定而均一的物質(zhì)，它的數(shù)值已由決定性方法確定，或由高度準(zhǔn)確的若干方法確定，所含雜質(zhì)也已經(jīng)定量，且有證書(shū);用于校正決定性方法，評(píng)價(jià)及校正參考方法以及為二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品定值。

2.二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品(次級(jí)參考物) 也稱(chēng)校準(zhǔn)品，包括用于常規(guī)分析的標(biāo)準(zhǔn)液。這類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品可由實(shí)驗(yàn)室自已配制或?yàn)樯唐罚�它的示值必須用一�?jí)標(biāo)準(zhǔn)品和參考方法并由訓(xùn)練有素的，能熟練掌握參考方法的操作者確定;主要用于常規(guī)方法的評(píng)價(jià)或?yàn)榭刂莆锒ㄖ岛统Ｒ?guī)測(cè)定的結(jié)果計(jì)算。

3.校準(zhǔn)品 用二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品和常規(guī)方法測(cè)定得到校準(zhǔn)品，用于常規(guī)測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)。

國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)(IFCC)提出：常規(guī)方法應(yīng)具有實(shí)用性和可靠性?xún)煞矫娴男阅苤笜?biāo)，至于某一項(xiàng)具體分析方法所應(yīng)具有的性能標(biāo)準(zhǔn)，可由臨床化學(xué)家根據(jù)采用這一試驗(yàn)的目的決定。

(1)實(shí)用性：一般應(yīng)具備微量快速，便于急診;費(fèi)用低廉;應(yīng)用安全。

(2)可靠性：一般具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，以及較大的檢測(cè)范圍。精密度即變異系數(shù)(CV%)一般應(yīng)小于5%。準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與"真值"的符合程度，一般偏差系數(shù)(CB)應(yīng)小于5%。特異性是指只對(duì)待測(cè)物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，不與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物發(fā)生反應(yīng)。檢測(cè)能力即"檢測(cè)限度"或"檢出限"。檢出限通常是指能與適當(dāng)?shù)?quot;空白"讀數(shù)相區(qū)別的待測(cè)物的最小量。

二、臨床生化檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)

方法學(xué)評(píng)價(jià)的基本內(nèi)容是通過(guò)實(shí)驗(yàn)途徑，測(cè)定并評(píng)價(jià)方法的精密度與準(zhǔn)確度，在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是不精密度與不準(zhǔn)確度，無(wú)論是精密度還是準(zhǔn)確度，強(qiáng)調(diào)的都是誤差，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程就是對(duì)誤差的測(cè)定。

(一)精密度評(píng)價(jià)

1. 目的要求 評(píng)價(jià)方法給出結(jié)果的可重復(fù)程度即精密度。

2.評(píng)價(jià)前的準(zhǔn)備 ①對(duì)于評(píng)價(jià)對(duì)象和評(píng)價(jià)方案均應(yīng)熟悉。②實(shí)驗(yàn)用試劑應(yīng)是同批次配制，或同一批號(hào)的商品試劑盒和參考物，儀器也應(yīng)處于良好的工作狀態(tài)。③實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本一般選擇2個(gè)(亦可更多)，一個(gè)在正常范圍或在醫(yī)學(xué)決定水平附近，另一個(gè)為異常值，被測(cè)物在疾病時(shí)增高者用高值，降低者用低值;實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的介質(zhì)應(yīng)與臨床標(biāo)本一致，并應(yīng)妥善保存，應(yīng)保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穩(wěn)定。④先作一個(gè)初步的批內(nèi)精密度測(cè)定，即一個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算出均值，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

3.評(píng)價(jià)步驟 用2個(gè)標(biāo)本每天測(cè)定2次(2次測(cè)定間隔不得少于2小時(shí))，每次測(cè)定均作雙份，共測(cè)定20天。每次測(cè)定至少做一個(gè)質(zhì)控。

(二)準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

1.方法比較試驗(yàn) 目的是評(píng)價(jià)方法所給出的結(jié)果是否準(zhǔn)確，在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)兩方法間的平均差異，并確定偏差。

(1)要求 方法比較試驗(yàn)理論上是兩種方法間的差異均作為試驗(yàn)方法的偏差。因此比較方法應(yīng)是參考方法或推薦方法，如該測(cè)定沒(méi)有參考方法或推薦方法亦可用公認(rèn)的常規(guī)方法。但須具備：①比較試驗(yàn)方法有更好的精密度。②干擾影響已知。③與試驗(yàn)方法使用相同的計(jì)算單位。

(2)比較前準(zhǔn)備 ①實(shí)驗(yàn)者應(yīng)熟悉所用的儀器、試驗(yàn)方法、比較方法和評(píng)價(jià)方案。②實(shí)驗(yàn)標(biāo)本應(yīng)收集新鮮的正常和異常的臨床標(biāo)本，應(yīng)有足夠?qū)挼臐舛确秶�，各濃度�?yīng)有合適的比例。

(3)方法比較步驟 ①樣本數(shù)至少為40個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本用2種方法分別作雙份測(cè)定。②每天測(cè)定8個(gè)標(biāo)本，雙份測(cè)定時(shí)第一次按順序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共測(cè)試5天。

2.回收試驗(yàn) 所謂回收即分析方法正確測(cè)定加入常規(guī)分析樣品中的純分析物的能力。目的是測(cè)定比例系統(tǒng)誤差，以衡量候選方法的準(zhǔn)確度。

(1)方法：將被分析的純品標(biāo)準(zhǔn)液加入樣品中，成為分析樣品，原樣品加入同量的無(wú)分析物的溶液作基礎(chǔ)樣品，然后用實(shí)驗(yàn)方法分析，兩者測(cè)定結(jié)果的差值為回收量。

(2)回收率計(jì)算：理想的回收率為100%，如某法測(cè)血鈣的回收率為95.7%，有4.3%的比例誤差，表明一個(gè)含鈣真值為2.5mmol/l的標(biāo)本,若用該方法測(cè)定,約為2.39mmol/l(2.5×95.79% )，誤差為0.11mmol/L(2.5Χ4.3%)。

(3)注意事項(xiàng)：① 準(zhǔn)確吸量; ② 樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)液后,總的濃度必須在方法的分析范圍內(nèi)，一般須加入高、中、低不同濃度做回收試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率;③ 加入標(biāo)準(zhǔn)液后，最好使實(shí)驗(yàn)樣品的被測(cè)濃度達(dá)到醫(yī)學(xué)決定濃度; ④ 加入標(biāo)準(zhǔn)液的體積一般在10%以?xún)?nèi)。若稀釋過(guò)大，誤差將發(fā)生改變，甚至消失。

(三)線(xiàn)性評(píng)價(jià)

1.目的要求 線(xiàn)性范圍能判斷對(duì)某一分析方法測(cè)得的濃度或活性值與設(shè)定的濃度或活性值之間的比例關(guān)系的范圍。常規(guī)方法應(yīng)具有較寬的分析范圍，一般應(yīng)覆蓋臨床可能出現(xiàn)的高值。

2.評(píng)價(jià)前準(zhǔn)備 ①熟悉儀器、評(píng)價(jià)方案和試劑。②評(píng)價(jià)標(biāo)本的介質(zhì)應(yīng)與實(shí)際測(cè)定的標(biāo)本相一致，理想的標(biāo)本是病人的低值或高值標(biāo)本。③濃度范圍應(yīng)以分析項(xiàng)目的線(xiàn)性要求為準(zhǔn)。線(xiàn)性評(píng)價(jià)應(yīng)有5個(gè)不同濃度，可選擇低值和高值標(biāo)本各一個(gè)，低值標(biāo)本為1號(hào)，高值標(biāo)本為5號(hào)，二者3：1混勻?yàn)?號(hào)，等份混勻?yàn)?號(hào)，1：3混勻?yàn)?號(hào)，2-4號(hào)標(biāo)本的濃度按下式計(jì)算：

標(biāo)本濃度 = (C1V1 + C5V5)/(V1 + V5)C = 濃度，V = 體積。

(四)干擾試驗(yàn)

1.目的要求 判斷評(píng)價(jià)方法給出的結(jié)果是否受非分析物影響及影響程度。①干擾是指在測(cè)定某分析物的濃度或活性時(shí)，受另一非分析物影響而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果增高(正干擾)或降低(負(fù)干擾)。②干擾物質(zhì)可分為內(nèi)源性(標(biāo)本中存在的)和外源性(外界污染的)兩類(lèi)。③干擾的機(jī)理，可有物理作用、化學(xué)作用以及非特異反應(yīng)等。④干擾可能是造成誤差的一個(gè)重要原因，如果干擾物是恒定的將引起恒定誤差，如干擾物隨病理生理因素影響，將引起隨機(jī)誤差。

2.試驗(yàn)前準(zhǔn)備 ①應(yīng)做的主要干擾物為病人標(biāo)本中常常出現(xiàn)的黃疸，脂血和溶血;某些藥物如維生素C等;實(shí)驗(yàn)常用的抗凝劑，防腐劑和穩(wěn)定劑。②質(zhì)量保證，不存在系統(tǒng)誤差;批內(nèi)精密度在可接受范圍內(nèi);應(yīng)不存在前后結(jié)果的交叉污染;實(shí)驗(yàn)過(guò)程有質(zhì)控監(jiān)督。

3.干擾試驗(yàn)方法

(1)"配對(duì)差異"試驗(yàn):即將不同濃度的干擾物加入到實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中，然后分別測(cè)定加與不加干擾物的標(biāo)本，比較二者有無(wú)偏差，并了解干擾物濃度與偏差程度的關(guān)系。

(2) 用病人標(biāo)本作偏差分析: ① 本分析用來(lái)證實(shí)某類(lèi)病人標(biāo)本中是否存在未知的干擾物;進(jìn)一步肯定加入干擾物實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。② 選擇2組病人標(biāo)本，一組含疑似干擾物為測(cè)定組，另一組不含疑似干擾物作為對(duì)照組，兩組的分析物濃度范圍應(yīng)大致相同，每組標(biāo)本需20~40個(gè)。③ 兩組樣品分別用試驗(yàn)方法和比較方法(參考方法)雙份測(cè)定，并在2小時(shí)內(nèi)完成。④ 分別比較每組樣品，兩種方法間的差異，如測(cè)定組有差異，對(duì)照組無(wú)差異說(shuō)明存在干擾，如兩組均無(wú)顯著差異說(shuō)明不存在干擾。

4.試驗(yàn)步驟 ①實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)選擇混合血清1份，分成2份，1 份加入干擾物，含量為臨床標(biāo)本中可能出現(xiàn)的最高含量，另一份不加，按比例混合成5個(gè)不同干擾物濃度。(見(jiàn)線(xiàn)性評(píng)價(jià))②每份標(biāo)本重復(fù)測(cè)定n次。
 

(五)統(tǒng)計(jì)分析及評(píng)價(jià)

1.精密度統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)

(1) 離群點(diǎn)的檢查 如每次雙份測(cè)定的差值超過(guò)初步精密度測(cè)定時(shí)±標(biāo)準(zhǔn)差的5.5倍(是99.99%的上限值)，這時(shí)數(shù)據(jù)為"離群點(diǎn)"，應(yīng)棄去或重做。

(2) 統(tǒng)計(jì)分析 見(jiàn)計(jì)算公式。例如日平均均值=0.949 , S日間(B) = 0.033.

CV日間 = B/日平均均值×100% = 3.48%

S批間(A)= n = 測(cè)定天數(shù)

CV批間 = A/日平均均值×100% = 2.46%

S批內(nèi)(A)=

CV批內(nèi) = S批內(nèi)/日平均均值×100% = 2.23%

S總 =

CV總 = S總/日平均均值×100% = 4.19%

2.準(zhǔn)確度統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)

(1) 方法內(nèi)雙份測(cè)定的離群點(diǎn)檢查 計(jì)算每一標(biāo)本的DX和DY以及DX′和DY′。如分別超過(guò)DX和DY以及DX′和DY′值的4倍為離群點(diǎn)，應(yīng)剔除，如出現(xiàn)一個(gè)以上離群點(diǎn)，應(yīng)查找原因，必要時(shí)重做。

(2) 試驗(yàn)方法(Y)與比較方法(X)相關(guān)性 如 r≥0.975或r2≥0.95說(shuō)明二法的相關(guān)良好。

3.線(xiàn)性評(píng)價(jià)方法

(1) 測(cè)定結(jié)果 5個(gè)不同濃度的標(biāo)本，隨機(jī)排列，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定4次，因此標(biāo)本應(yīng)有足夠的量，并且分析要求在當(dāng)天完成。

(2) 離群點(diǎn)檢查 將每個(gè)標(biāo)本(X1到X5)4次測(cè)定的結(jié)果排列在Y1-Y4，如數(shù)據(jù)超過(guò)界限值P0.05 = 0.765和P0.01 = 0.889為離群點(diǎn)。

(3) 線(xiàn)性評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì) 采用回歸分析。

(4) 稀釋變異試驗(yàn) 界限值P0.05 = 0.6841; P0.01 = 0.7814;如

(5) 線(xiàn)性失擬檢查 界限值F0.05 = 3.29; F0.01 = 5.42;如< F0.05說(shuō)明線(xiàn)性良好。

4.干擾實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)

計(jì)算分析干擾 各組均值 - 未加干擾物相應(yīng)組的均值 = 干擾值。對(duì)照這一濃度±1.96 s，可得出某濃度內(nèi)有無(wú)干擾。

如Bias<允許誤差(EA)的臨界值(EA為可允許誤差的95%限度)，表明由于干擾物引起的偏差對(duì)臨床診斷和治療不產(chǎn)生不良的影響，是可以被接受的。

三 方法學(xué)性能分析

方法學(xué)性能標(biāo)準(zhǔn)也稱(chēng)分析目標(biāo)，由允許分析誤差和醫(yī)學(xué)決定水平這兩項(xiàng)內(nèi)容決定。① 允許分析誤差 用EA表示，它被規(guī)定為95%樣品的允許誤差限度;② 醫(yī)學(xué)決定水平 用XC表示，是臨床判斷結(jié)果具有意義的被分析物濃度。制定的性能標(biāo)準(zhǔn)，既應(yīng)反映臨床應(yīng)用與解釋結(jié)果的要求，稱(chēng)為醫(yī)學(xué)效用限度，又應(yīng)基本符合實(shí)驗(yàn)室所能達(dá)到的技能狀態(tài)。

候選方法可否被接受，最后根據(jù)評(píng)價(jià)方案中的誤差結(jié)果進(jìn)行歸納，作出判斷。任何一項(xiàng)指標(biāo)大于可允許誤差，該方法都不能接受。如果候選方法被得出可接受性的結(jié)論，那么接著就要進(jìn)行評(píng)價(jià)后實(shí)驗(yàn)，包括參考值的制定，制定的參考值及其范圍應(yīng)符合以前公認(rèn)的調(diào)查報(bào)告;質(zhì)控觀察，應(yīng)符合室內(nèi)質(zhì)控的要求;臨床病例的觀察等。最后進(jìn)入方法應(yīng)用階段。