第七章　臨床生化自動化分析

自動生化分析儀將生化分析中的取樣、加試劑、混勻、保溫反應、檢測、結果計算、可靠性判斷、顯示和打印、以及清洗等步驟組合在一起自動操作。按其工作方式不同分為連續流動式或管道式、分立式、離心式和干片式。

一、分立式自動生化分析儀的結構

(一)基本結構

1.樣品盤或樣品架 樣品盤是能放置樣品杯或采血試管的轉盤;樣品架是能放置樣品杯或采血試管的架子，可通過樣品傳送帶進行移動，其優點是可不斷追加新的樣品架，以及能將樣品傳送到另一分析模塊甚至另一分析儀上再進行分析。

2.試劑室和試劑瓶 試劑室內可裝有放置試劑瓶的轉盤，轉盤轉動時某一試劑瓶內試劑被吸取;或擺放許多試劑瓶，每個試劑瓶內引出一條試劑管路及其噴嘴。試劑室均具有冷藏裝置。大型分析儀常有第一試劑室和第二試劑室。

3.反應杯和反應盤 反應杯即作反應管又作比色杯，由透光性好的硬塑料或石英玻璃制成，反應杯圍成一圈組成一個反應盤，在測定過程中作恒速圓周運動，靜止時向反應杯中加入樣品、試劑或進行攪拌混勻，相對靜止時經過檢測窗口的比色杯可進行吸光度檢測。

4.取樣和加試劑裝置 取樣裝置由取樣針、取樣臂、取樣管路、取樣注射器和閥門組成，取樣針尖具液面感應功能，并設有防撞裝置。取樣針大多數采用水洗方式，也有采用化學惰性液的方式。加試劑裝置有兩類，一種類型的組成與取樣裝置類似，其液面感應系統能檢測并提示試劑剩余量。另一種類型為灌注式，每種試劑單獨使用一條試劑管路和噴嘴，因而不存在各試劑間的交叉污染。

5.混勻與攪拌裝置 樣品與試劑通過棒攪充分混勻。

6.溫控和定時系統 反應杯浸浴在恒溫循環水或恒溫空氣中。檢測吸光度有一定間隔時間，總反應時間一般在8-10min內。

7.光路和檢測系統 光源一般為鹵素鎢絲燈，也有采用長壽命的氙燈。單色器采用干涉濾光片分光系統，或光柵分光系統，常用波長有340、380、405、500、550、600、660nm等。光柵分光有前分光和后分光兩種方式，后分光是光源先透過比色杯中的反應液再照射到光柵上。檢測器由光敏二極管及放大電路組成。

8.數據處理系統 能計算測定結果、判斷結果準確性、保存各種數據和自我診斷功能等。

9.清洗系統 反應和檢測結束后反應杯就被沖洗系統及時沖洗，然后做杯空白吸光度檢查;樣品針、試劑針和攪拌棒一般在用于下一個樣品、試劑或反應杯前即清洗一次;在一批檢測完成后，則自動進行清洗劑清洗，清洗劑可配有1至3種。

(二)組合式自動分析儀

組合式自動生化分析儀將相同或不同的兩臺或兩臺以上的分析部分，采用樣品架方式使樣品通過傳輸線在不同分析模塊間進行傳遞并檢測。實驗室自動化系統組合各自動分析系統如生化分析系統、免疫分析系統以及血液分析系統等，可包括樣品前處理系統、樣品輸送系統和各樣品分析系統。

二、生化自動化分析方法概要

(一)分析方法類型

1.終點法 被測物質在反應過程中完全被轉變為產物，根據終點吸光度的大小求出被測物濃度，實際上稱為平衡法更為恰當。

一點終點法是在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值計算結果。兩點終點法則在被測物反應或指示反應尚未開始時選擇第一個吸光度，在反應到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，將兩點吸光度之差計算結果。該法能有效地消除溶血、黃疸和脂濁等樣品本身光吸收造成的干擾。在雙試劑分析中，如果將第一吸光度選擇在第二試劑加入前，此時指示反應一般尚未開始，則能容易設置兩點終點法。

2.固定時間法 指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非反應初始吸光度亦非終點吸光度，這兩點的吸光度差值用于結果計算。該分析方法有助于解決某些反應的非特異性問題，例如苦味酸法測定肌酐。

3.連續監測法 又稱速率法，是在測定酶活性或用酶法測定代謝產物時，連續選取時間-吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此期單位時間吸光度變化值(ΔA/min)計算結果。該法的優點是可以確定線性期并計算ΔA/min，從而可準確計算酶活性。連續監測法也可用于測定呈線性反應的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。

4.透射比濁法 抗原與相應的抗體結合形成的免疫復合物，在反應液中具有一定的濁度，進行透射比濁測定，可用于某些蛋白質和藥物濃度等的測定。

(二)常用生化檢測項目分析方法舉例

1.終點法檢測　總膽紅素、結合膽紅素、血清總蛋白、血清白蛋白、總膽汁酸、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇(直接測定法)、鈣、磷(紫外法)、鎂等。

2.固定時間法　苦味酸法測定肌酐等。

3.連續監測法　酶活性如丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ谷氨氨酰基轉移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定如葡萄糖(己糖激酶法)、尿素(脲酶偶聯法)等。

4.透射比濁法　載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質如前白蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白等。

三、分析參數設置

(一) 分析參數介紹

1.必選分析參數 是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數無法進行檢測。包括試驗名稱(test code)、方法類型(也稱反應模式)(assay mode)、反應溫度、主波長(primary wavelength)、次波長(secondary wavelength)、反應方向(response direction)、樣品量(sampling volum，一般是2μl～35μl，以0.1μl步進，個別分析儀最少能達到1.6μl。可設置常量、減量和增量)、第一試劑量 (first reagent volum一般是20～300μl，以1μl步進)、第二試劑量(second reagent volum)、總反應容量(total reacting volum，一般是180～350μl，個別儀器能減少至120μl)、孵育時間(incubate time，在終點法是樣品與試劑混勻開始至反應終點為止的時間，在兩點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點止的時間)、延遲時間(delay time，連續監測法中樣品與反應試劑混勻開始至連續監測期第一個吸光度選擇點之間的時間)、連續監測時間(continuous monitoring time，延遲時間之后即開始，一般為60～120s，不少于4個吸光度檢測點)、校準液(calibrator)個數及濃度或或理論K值、小數點位數(decimal point digit)。

2.備選分析參數　這類分析參數與檢測結果的準確性有關，一般來說不設置這類分析參數，分析儀也能檢測出結果。包括線性范圍(linearity range)、樣品預稀釋、底物耗盡值(substrate exhaust limit，在負反應的酶活性測定中，規定的吸光度下降限。若低于此限時底物已太少，不足以維持零級反應而導致檢測結果不準確)、前區檢查(將終點法最后兩個吸光度值的差別設置一個限值，如果后一點的吸光度比前一點低，表示已有抗原過剩)、試劑空白吸光度范圍、試劑空白速率、方法學補償系數(用于校正不同分析方法間測定結果的一致性，有斜率和截距兩個參數)、參考值范圍。

3.某些參數的特殊意義 最小樣品量、最大試劑量、彈性速率和試劑空白速率等。彈性速率(flexrate)指在酶活性測定中，酶活性太高時在連續監測期中已不呈線性反應時，有些儀器具有彈性速率功能，能自動選擇反應曲線上連續監測期中仍呈線性的吸光度數據計算結果。

(二)單波長和雙波長方式

采用一個波長檢測物質的光吸收強度的方式稱為單波長方式，使用一個主波長和一個次波長的稱雙波長方式。雙波長測定能①消除噪音干擾;②減少雜散光影響;③減少樣品本身光吸收的干擾。選擇次波長應使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應有較大的差異，一般來說，次波長應大于主波長100nm。

(三)單試劑和雙試劑方式

反應過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優點是：①可提高試劑的穩定性;②能設置兩點終點法;③在某些項目檢測時能消除非特異性化學反應干擾。

(四)測定過程的自動監測

1.試劑空白監測　試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質。

2.試劑空白變化速率監測　一些酶試劑或其他試劑在反應溫度下不穩定，其空白吸光度可隨著時間逐漸發生變化，這種變化會影響測定結果的準確性。設置此項監測可使分析儀在結果計算時自動減去試劑空白變化速率。

3.樣品信息監測　根據溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質和程度，然后在結果計算時自動減去這部分干擾。

4.結果可靠性監測 終點監測：判斷所選的測光點是否到達終點或平衡點。線性期監測：①將連續監測到的各吸光度值進行線性回歸，根據各點方差值的大小來判斷是否呈線性;②取連續監測期開始若干點的變化速率與連續監測期最后若干點的變化速率進行比較來判斷是否為線性期。

5.底物消耗的監測　在連續監測法測定酶活性時，如果在監測期內吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡。

6.方法線性范圍監測
 

四、自動生化分析儀的工作過程和操作方法

(一)工作過程

在測定過程中所有機械步驟均由微處理器根據已設定的程序進行工作。包括取樣加試劑和混勻、保溫反應和吸光度檢測和計算并顯示或打印結果。

(二)操作方法

操作步驟如下：

1.操作前的各項檢查

2.校準 校準方式有單點校準、兩點校準和多點校準，多點校準可按其線形選擇不同的曲線方程進行擬和，如雙曲線、拋物線、冪函數、指數函數、對數函數等方程等。校準頻度按檢測方法原理和試劑的穩定性不同而確定，如每日校準、每周校準、每月校準、每兩月校準等，至少每六個月進行一次校準。

3.質控品測定

4.檢測項目的輸入與測定

5.樣品的減量重做

6.分析儀維護 要嚴格根據操作手冊的要求，進行每天維護、每周維護、不定期維護等。

7.分析儀數據連網 指分析儀與實驗室網絡系統之間分析數據的互傳與共享。

(三)自動化分析與手工操作的比較

1.優點 包括檢測速度快、檢測靈敏度高、檢測準確度高、檢測精密度高、樣品和試劑用量少，以及能精確地控制反應時間、精確地控制反應溫度和進行復雜的結果計算等。

2.缺點　選擇次波長較困難、操作時間受限、操作復雜性受限(如加試劑的次數，無法離心、過濾、萃取、煮沸，選擇和改變反應溫度困難等)、樣品量/試劑量的比例受限制、不適宜做參考方法，以及儀器維護和保養較復雜等。

五、干片式生化分析儀簡介

由干片試劑和檢測儀器兩部分組成，前者從上到下分為展開層、試劑層、顯色層和支持層，檢測儀器也有半自動和全自動之分。測定不同待測物利用不同的方法原理。樣品在干片試劑各層中的反應過程如下：

(1)待測樣品在展開層樣品均勻展開，大分子物質被阻擋不能進入試劑層。

(2)樣品中的水分進入試劑層成為干式試劑的溶劑，試劑與待測物質進行化學反應。

(3)化學反應產物在顯色層與顯色試劑起呈色反應。

(4)經過一定時間，光度計的單色光透過支持層、顯色層和試劑層，一部分光線被吸收，另一部分光線則反射到接收器被檢測。

六、自動生化分析儀性能評價

生化分析儀有全自動和半自動之分。全自動分析儀將取樣至出結果的全過程都自動完成。半自動分析儀的工作原理為連續流動式分析，不同樣品反應液之間互染率大，每個樣品檢測后均需沖洗才能進行下一個測定，某些步驟如加試劑、取樣、混合、保溫等需手工完成。

生化分析儀的分析性能也包括準確度、精密度、檢測范圍等，另外，分析速度是自動生化分析儀最重要的分析性能。

(一)分析速度

影響分析速度的因素有通道數量、取樣周期、反應杯數量、一次能容納的樣品數量、試劑瓶容量、合適的項目組合等。

(二)分析儀性能指標

自動生化分析儀的性能可包括五個方面：準確度、精密度、檢測能力(包括檢測方法、檢測時間、加試劑次數、檢測范圍等)、分析速度和檢測成本，分析儀生產廠家關于其分析儀的介紹資料中通常列出許多性能指標，這些指標實際上是這五方面性能的解釋。