第三節(jié) 分子生物學與外科疾病治療
隨著在分子水平對疾病的發(fā)病機制研究的不斷深入，以及基因工程技術的飛速發(fā)展，通過分子生物學技術對外科疾病進行干預和治療已成為可能。目前，分子生物學技術在腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移、器官移植供體提供與排斥反應、嚴重感染、創(chuàng)傷后組織愈合等外科難題的解決提供新的途徑。
一、基因治療策略及技術
（一） 基因治療策略
基因治療（gene therapy）是指通過轉(zhuǎn)基因技術在特定的靶細胞表達特定基因，或封閉、抑制異常表達基因，以達到治療疾病的目的，其基本策略包括：
1. 基因置換 將正常外源基因?qū)�入病變細胞，置換有缺陷的致病基因，并盡量使基因組不發(fā)生其他改變，達到定點整合或基因打靶（gene target）的目的。
2. 基因修正 大多數(shù)單基因遺傳病的致病基因是發(fā)生點突變，而基因其他部位的編碼及調(diào)控結構是正常的，因而不必進行整個基因置換，而只在原位修復致病基因的突變，這種方法稱為基因修正。
3. 基因修飾 指并不去除異常基因，而是通過外源基因的非定點組合，將功能性目的基因?qū)�入病變細胞或其他相關細胞。外源基因的表達產(chǎn)物可彌補致病基因的缺陷功能，或能表達靶細胞原先所不具備的產(chǎn)物，以達到治療疾病的目的。
4. 基因封閉 導入的外源基因可以特定的方式作用于致病基因，抑制或破壞致病基因的表達。常用方法有：①反義RNA技術 通過體外合成的反義RNA或構建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，利用堿基互補原理結合細胞中特異mRNA以調(diào)控其翻譯。②核酶技術 具有催化功能的RNA被稱為核酶（ribozyme），核酶通過兩端引導序列與mRNA結合后將其切斷，并可從雜交鏈上解脫并重新結合和切割其他mRNA。
（二）基因轉(zhuǎn)移技術
基因轉(zhuǎn)移技術有生物學方法和非生物學方法兩類，前者主要指利用攜帶外源基因的缺陷病毒感染靶細胞，后者指用物理或化學方法將DNA導入細胞。基因轉(zhuǎn)移常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純皰疹病毒載體等。基因轉(zhuǎn)移的非生物學方法主要有脂質(zhì)體、受體介導的基因轉(zhuǎn)移、DNA-磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、顯微注射法、顆粒轟擊等。
二、分子生物學與腫瘤治療
（一）腫瘤致病基因相關基因治療
1. 以癌基因為靶基因 對于過度活化的癌基因可用基因封閉的方法，體外合成與致病癌基因mRNA互補的反義RNA或核酶，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯以關閉癌基因的表達。
2. 以抑癌基因為靶基因 對于抑癌基因失活的惡性腫瘤，可通過基因修飾轉(zhuǎn)入具有正常功能的野生抑癌基因，或通過基因置換將外源基因與缺陷的抑癌基因進行同源重組，重建失活的抑癌基因功能以控制腫瘤的異常生長。
（二）腫瘤免疫相關基因治療
1. 增強腫瘤細胞的免疫原性 轉(zhuǎn)染主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex, MHC）基因以增強腫瘤細胞MHC抗原的表達，加強免疫效應細胞對腫瘤細胞的識別。另一途徑就是促進腫瘤抗原的表達，采用病毒基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，使細胞膜上表達病毒抗原，從而誘導機體免疫系統(tǒng)對病毒抗原的免疫應答，達到消滅腫瘤細胞的目的。
2. 增強免疫細胞的抗腫瘤效應 通過向靶細胞如腫瘤浸潤細胞（TIL）、淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK細胞）等轉(zhuǎn)移細胞因子基因如白細胞介素類（IL-2、IL-4、IL-6）、干擾素類（IFN-α、IFN-β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF），直接殺傷腫瘤或通過刺激免疫網(wǎng)絡間接發(fā)揮腫瘤殺傷作用。
3. 腫瘤基因疫苗 腫瘤基因疫苗是以腫瘤特異性抗原（tumor special antigen，TSA）、腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA）、突變的癌基因以及腫瘤相關的病毒蛋白等的編碼基因為目的基因，構建攜帶上述基因的重組DNA質(zhì)粒直接注射到體內(nèi)，通過表達上述抗原蛋白誘導機體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫。
4. 誘導腫瘤細胞凋亡 有研究者將Fas抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，當免疫效應細胞表面的Fas配體（FasL）與腫瘤細胞表面表達的Fas抗原結合后，腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
（三）腫瘤化療相關基因治療
1. 腫瘤耐藥的基因治療 通過構建MDR-1 mRNA序列特異性的反義寡核苷酸或核酶，抑制MDR-1表達P-糖蛋白以提高腫瘤對化療藥物的敏感性。
2. 腫瘤自殺基因的治療 自殺基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞后，通過其代謝作用可將無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性藥物，從而達到特異性殺滅腫瘤細胞的目的。常用的腫瘤自殺基因包括單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、水痘-帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因等。
3. 誘導正常細胞的耐藥治療 腫瘤化療的一個非常嚴重的副作用就是骨髓抑制問題，國外已經(jīng)在臨床中開展人MDR-1基因轉(zhuǎn)入晚期癌癥患者的造血干細胞實驗研究。此外，將集落刺激因子基因轉(zhuǎn)入造血干細胞亦可緩解腫瘤化療藥物對骨髓的抑制作用。
（四）腫瘤轉(zhuǎn)移相關的基因治療
金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）可與癌細胞分泌的包括膠原酶在內(nèi)的多種金屬蛋白酶相結合并抑制其活性，從而保持血管基底膜的完整性。因此，通過轉(zhuǎn)導TIMP基因以加強其表達，在一定程度上可阻止癌細胞的轉(zhuǎn)移。另一策略是抑制腫瘤新生血管生成，目前研究較多的是血管內(nèi)皮生長抑制因子，可特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增殖。
三、分子生物學與器官移植
隨著移植免疫排斥反應和免疫抑制藥物研究的進展，人們已經(jīng)在臨床開展包括心臟、肺臟、肝臟、胰腺、腎臟在內(nèi)的多種器官移植。對于有器官功能衰竭或因患惡性腫瘤而行器官切除的患者，器官移植是最終的替代途徑，因而器官移植是未來外科發(fā)展的必然趨勢。盡管目前器官移植研究已取得了較大進展，供體器官的不足和移植免疫排斥反應極大地制約了移植外科在臨床中的應用
（一）分子生物學與同種移植
1. 分子生物學與移植配型 在同種器官移植前進行組織相容性配型是極為重要的。以往通過組織學、血清學和細胞學方法在蛋白水平進行組織相容性抗原的測定，隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們可應用序列特異性低核苷酸雜交、限制性長度多態(tài)性以及凝膠電泳等方法在基因水平進行組織相容性抗原的配型。
2. 分子生物學與同種移植排斥反應 目前臨床常用的免疫抑制劑均非特異地抑制機體的免疫反應以維持移植器官的存活，處于免疫抑制狀態(tài)的宿主則很容易受到細菌或病毒的感染，且腫瘤的發(fā)生率大大增加。分子生物學技術的發(fā)展使我們能夠干預移植免疫反應的特定環(huán)節(jié)以誘導移植免疫耐受，而不是造成機體的免疫抑制狀態(tài)。如利用基因工程重組技術獲得的抗CD3、抗CD4、CTLA4等單克隆抗體可與T細胞表面免疫刺激分子結合以抑制免疫刺激信號的傳導，從而有效減弱移植排斥反應。此外，將免疫抑制基因如IL-10、TGF-β以及凋亡基因FasL等轉(zhuǎn)染移植物或免疫遞呈細胞，以誘導T細胞的無反應性或凋亡在同種移植的實驗研究中已取得較大進展。
3. 分子生物學與干細胞 干細胞是一種具有多種分化潛能的細胞，在一定的外界環(huán)境誘導下干細胞能分化成不同功能的組織和器官。通過特異性的分子基因標記篩選和鑒定人體多能干細胞，并在體外誘導多能干細胞向特定的細胞類型增殖分化，為細胞和器官移植提供新的來源。
（二）分子生物學與異種移植
1. 目前研究較多的是豬來源的供體器官，當豬器官移植于人時，體內(nèi)天然抗體與豬血管內(nèi)皮細胞上的α-1,3-半乳糖表位相結合，導致超急性排斥反應而使移植失敗。可利用基因敲除技術敲除α-1,3-GT基因或利用反義RNA技術抑制α-1,3-GT活性，從而消除或減少α-1,3-半乳糖表位的合成，以減輕異種移植排斥反應。
2.衰變促進因子（decay accelerating factor, DAF）是一種補體調(diào)節(jié)因子，可以抑制補體攻擊單位的活化，從而對超急性排斥反應起到抑制作用。國內(nèi)已有研究單位利用顯微注射技術將人類DAF成功轉(zhuǎn)入到豬的受精卵，從而獲得轉(zhuǎn)hDAF的轉(zhuǎn)基因豬。此種轉(zhuǎn)基因豬有望給異種移植的臨床應用帶來新的希望。